Avaliação da heterogeneidade molecular de Cryptosporidium sp. em amostras clínicas

O Cryptosporidium é um parasito coccídeo reconhecido por causar diarréia em humanos e animais em todo o mundo. O gênero compreende pelo menos 20 espécies confirmadas, sendo o C. hominis e C. parvum as principais espécies causadoras de criptosporidiose em humanos. Ferramentas moleculares têm sido desenvolvidas para detectar e diferenciar espécies/genótipos e subgenótipos de Cryptosporidium. O objetivo do trabalho foi avaliar a heterogeidade molecular de Cryptosporidium sp. obtidos de amostras clínicas provenientes dos municípios do Rio de Janeiro e de Salvador, através da PCR em tempo real e seqüenciamento automático. Foram analisadas 85 amostras, distribuídas em 3 grupos distintos, sendo 45 delas do município do Rio de Janeiro e 40 amostras provenientes de Salvador, Bahia. Todas as amostras foram positivas para Cryptosporidium sp. pelo método de coloração de Kinyoun a frio. O ensaio da PCR em tempo real combinou uma reação multiplex para a detecção do gênero Cryptosporidium e da espécie C. parvum e uma reação simples para a detecção de C. hominis. Na detecção do gênero Cryptosporidium foram utilizados par de primers e uma sonda TaqMan desenhados a partir do alinhamento de seqüências conservadas do gene 18S rRNA de várias espécies de Cryptosporidium disponíveis no GenBank. Para a detecção das espécies C. parvum e C. hominis foram utilizados primers e sondas específicos obtidos a partir de seqüências de cada espécie disponíveis no GenBank. A detecção do gênero Cryptosporidium através da sonda 18S rRNA, na reação duplex, foi visualizada em 63 de 85 amostras totais. Destas, a sonda TaqMan específica para C. parvum detectou 6 amostras e a sonda TaqMan específica para C. hominis detectou 42 amostras. Quinze amostras não puderam ser detectadas pelas sondas C. hominis ou C. parvum. Nos ensaios da PCR para o gene 18S, 31 amostras foram positivas e 27 delas sequenciadas. As análises filogenéticas confirmaram a presença de C. hominis, C. parvum e C. felis nas amostras estudadas. Na análise da topologia da árvore filogenética obtida por Neighbor Joining, observou-se-se que as sequências obtidas neste estudo se agruparam com espécies do gênero Cryptosporidium já descritas, com 99% ou 100% de similaridade. Conclui-se que os dois métodos utilizados são importantes ferramentas para o diagnóstico da criptosporidiose e diferenciação de C. hominis e C. parvum em investigações epidemiológicas, assim como avaliação da heterogeneidade molecular de Cryptosporidium sp

Epidemiologia molecular de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) isolados de pacientes com Fibrose Cística

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um importante patógeno pulmonar em pacientes com fibrose cística (FC). Caracteriza-se pela resistência a todos os β-lactâmicos, devido a presença do elemento genético móvel SCCmec o qual abriga o gene mecA. Além disso, é reconhecido por vários fatores de virulência o qual destacamos a toxina Panton-Valentine Leukocidin (PVL), uma citolisina formadora de poros na célula hospedeira, e por apresentar diversos clones epidêmicos envolvidos em surtos hospitalares. O objetivo desse estudo foi caracterizar a epidemiologia de MRSA, isolados de pacientes com FC referente a dois centros de referência no Rio de Janeiro a partir da aplicação de técnicas fenotípicas e genotípicas. Um total de 57 amostras de MRSA foi submetido ao teste de difusão em ágar para 11 antimicrobianos a fim de avaliar perfil de resistência, com aplicação da técnica da PCR foi tipificado o SCCmec e investigado a presença do gene LukS-PV responsável pela codificação da toxina PVL com intuito de estabelecer uma melhor caracterização epidemiológica dos clones identificados pela técnica do MLST (Multilocus Sequence Typing). Os antimicrobianos não β-lactâmicos apresentaram um percentual de resistência abaixo de 50%, em que destacamos a eritromicina com o maior percentual 45,6% e quanto ao perfil de resistência 24,6% foram multirresistentes. Com exceção do SCCmec II, os outros tipos foram encontrados (I, III, IV e V) com os respectivos percentuais de 22,8% (n=13), 7,1% (n=4), 61,4% (n=35) e 3,5% (n=2) e apenas 5,3% (n=3) das amostras não foram caracterizadas, não há dados da prevalência do SCCmec IV. Vinte (35,1%) amostras apresentaram produtos de amplificação compatível com a presença do gene lukS, aproximadamente metade dessas amostras (55%) estava correlacionada ao SCCmec IV. Com a análise do MLST, obtivemos os STs 1 (n=1, 1,7%), 5 (n=28, 49,1%), 30 (n=11, 19,3%), 72 (n=1, 1,7%), 398 (n=1, 1,7%), 1635 (n=7, 12,3%), 1661 (n=2, 3,5%), 239 (n=5, 8,8%), e ainda identificamos um novo ST (2732) presente em 1 amostra. A partir de uma análise associativa entre o MLST e o SCCmec foi possível observar a presença de linhagens características de clones epidêmicos, como o UK-EMRSA-3 (ST5, SCCmec I), USA 800/pediátrico (ST5, SCCmec IV), Oceania Southwest Pacific Clone - OSPC (ST30, SCCmec IV) e Brazilian Epidemic Clone - BEC (ST239, SCCmec III). Em conclusão este estudo é o primeiro a caracterizar linhagens epidêmicas de MRSA nos centros de atendimento a pacientes com FC no Rio de Janeiro, sendo necessário um monitoramento constante a fim de evitar a disseminação desses clones.

Perfil genético por sequenciamento e genotipagem de cepas multirresistentes do Mycobacterium tuberculosis provenientes de diversos estados brasileiros

A tuberculose multirresistente (MR) a drogas é uma séria ameaça à saúde pública devido à maiores complexidade, custo e efeitos colaterais do tratamento. Poucos estudos descreveram a epidemiologia molecular de isolados de Mycobacterium tuberculosis MR no Brasil. Neste trabalho foi investigada a diversidade genética e mutações associadas à resistência a drogas de 99 isolados MR e 7 não MR coletados em um período de 8 anos e provenientes de 12 estados brasileiros. Esta investigação foi feita através da análise do polimorfismo de fragmentos de restrição do elemento de inserção IS6110 (IS6110-RFLP), spoligotyping e sequenciamento de regiões dos genes rpoB e katG que conferem resistência aos antibióticos rifampicina e isoniazida, respectivamente. Mutações nos genes katG e rpoB foram encontradas em 90,9% e 93% dos isolados MR analisados, respectivamente. Para o gene rpoB, 91,9% das mutações estavam contidas na região RRDR de 81-pb. Um total de 51 (51.5%), 23 (23.3%) e 11 (11.1%) isolados MR apresentaram mutações nos códons 531, 526 e 516, respectivamente. Com relação ao gene katG, foram encontradas mutações em 93% dos isolados MR analisados, sendo que 7 apresentaram mutações apenas na primeira região analisada (katG1). O codon 315 da segunda região analisada do gene katG (katG2) apresentou mutações em 82.8% dos isolados MR, sendo a maioria Ser315Thr. A região katG1 apresentou mutações em 30.3% dos isolados MR sendo a maioria deleção do códon 4. Pelo spoligotyping foi possível determinar que os isolados MR deste estudo pertencem a 5 diferentes famílias (com suas subfamílias) de M. tuberculosis circulantes no Brasil, onde as mais frequentemente encontradas foram: LAM (46%), T (17%) e H (12%). Nós observamos que uma das famílias, a EAI5, carrega mutações no códon 463 do gene katG, o que não ocorre para as demais. Além disso, entre nossos isolados foi identificada um isolado pertencente à cepa Beijing (extremamente virulenta), mas este fato não é alarmante já que se tratou de apenas um caso. Através de nossos dados foram descritos novos alelos mutados para os genes rpoB e katG. Com exceção da família X2, foi identificada uma região inicial do gene katG com alta frequência de mutações nos isolados MR. A análise por IS6110-RFLP revelou que 25 isolados formaram 11 grupos genotípicos enquanto 74 mostraram um padrão único de bandas. Esta alta taxa de polimorfismo indica aquisição independente de resistência entre nossos isolados. Para a família H, foi identificada uma inversão na freqüência de ocorrência de mutações no gene rpoB, sendo o códon 516 o mais mutado, seguido pelo 526 e 531. Os resultados deste estudo fornecem informações úteis para um melhor entendimento do espectro de mutações dos isolados MR de pacientes no Brasil. Nossos resultados também se tornam úteis no desenvolvimento de testes diagnósticos de tuberculose MR e para auxiliar no rastreamento da transmissão global desta doença.

Caracterização e diversidade molecular do transposon Tn1546, carreador do gene vanA, responsável pela expressão de resistência à vancomicina, em amostras clínicas de diferentes espécies de Enterococcus

Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE) são reconhecidos como importantes patógenos causadores de infecções nosocomiais, configurando um grave problema de saúde pública, principalmente pela escassez de opção terapêutica eficaz. O fenótipo de resistência VanA é o mais frequente, sendo definido pela resistência a altos níveis de vancomicina e teicoplanina. VanA é caracterizado por um conjunto gênico (vanRSHAXYZ) localizado no elemento genético móvel denominado transposon Tn1546. A diversidade de Tn1546 resulta de alterações estruturais promovidas por deleções ou integração de sequências de inserção (IS) que, exercem papel chave na evolução do elemento VanA, modificando os aspectos relacionados à sua transferência e expressão do fenótipo. O objetivo deste estudo foi caracterizar e avaliar o polimorfismo de elementos Tn1546 presentes em amostras de diferentes espécies de Enterococcus isoladas em instituições hospitalares do Estado do Rio de Janeiro no período de 2000 a 2012. Foram incluídas neste estudo 70 amostras VRE que foram caracterizadas quanto ao gênero, espécies e genótipo de resistência aos glicopeptídeos por métodos convencionais e PCR multiplex. A susceptibilidade a 17 antimicrobianos foi avaliada pelo método de difusão em ágar, e concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina e teicoplanina foi determinada por microdiluição em caldo. O tranposon foi obtido após lise das células bacterianas e amplificação por PCR longo, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para a região repetida e invertida que flanqueia este elemento genético. A diversidade dos elementos Tn1546 foi avaliada por um conjunto de métodos moleculares que incluiu a análise do polimorfismo do tamanho de fragmentos de restrição (restriction fragment lenght polymorphism, RFLP), utilizando-se a endonuclease ClaI, amplificação de segmentos internos por PCR de sobreposição de oligonucleotídeos (overlapping PCR) e detecção de sequências de inserção (ISs). A caracterização em espécies considerada para as demais análises foi obtida pela metodologia de PCR de acordo com a seguinte distribuição: E. avium (N=6), E. faecalis (N=12), E. faecium (N=46), E. gallinarum (N=4) e E. raffinosus (N=2). Todas as amostras apresentaram o genótipo vanA. Nos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foi observado que todas as amostras foram multirresistentes, sendo resistente de 6 a 13 dentre os 17 antimicrobianos testados. A presença de elementos semelhantes ao arquétipo de Tn1546 foi observada em 61,5% das amostras; entretanto, 27 amostras apresentaram perfis variantes de Tn1546. Foram identificados nove perfis de RFLP, dentre 66 avaliadas, sendo o perfil I, prevalente e semelhante ao arquétipo de Tn1546. Não foi possível analisar quatro amostras por RFLP. Os produtos de amplificação de Tn1546 alterados, obtidos pela overlapping PCR e pelo rastreamento de IS, levaram à classificação de 15 tipos polimórficos, nomeados de A a O. A maioria dos Tn1546 polimórficos teve suas regiões de ORF1 e/ou ORF2 deletadas; e IS1542 juntamente com IS1216V foram as inserções mais frequentes, que em muitas situações compartilhavam a mesma região de inserção. IS19 foi detectada apenas na região vanS-vanH. Os dados apresentados neste estudo indicam que o polimorfismo de Tn1546 pode ser explorado no rastreamento de rotas de transmissão, acompanhamento da dispersão de elementos VanA e investigação da evolução de amostras VRE.